Catherine Frot voit le jour le 1er mai 1956 à Paris. Aînée de la fratrie, elle a une soeur (Dominique Frot également comédienne) et un frère. Issue d'une famille de scientifiques (son père est ingénieur et sa mère professeur de mathématiques), la fillette ne suit néanmoins pas la voie de ses parents. Elle est attirée par les arts et dès l'âge de 9 ans s'invente un personnage, Zavattine, en hommage à son idole, le clown Achille Zavatta. Elle monte des petits spectacles pour ses camarades de classe. A l'adolescence, après le divorce de ses parents, elle décide de réaliser son rêve de devenir actrice.
A 14 ans, elle entre donc au Conservatoire de Versailles, enchaîne avec l'Ecole de la Rue Blanche et parfait sa formation au Conservatoire de Paris. Elle refuse d'entrer à la Comédie-Française car elle préfère expérimenter une autre forme de théâtre. A 18 ans, elle fonde avec d'autres comédiens sa propre compagnie, La Compagnie du Chapeau Rouge. Pendant une dizaine d'années, la jeune comédienne fait ses armes sur les planches. Elle s'affaire à tous les postes au sein de la troupe, participe à la création de pièces contemporaines et reprend les rôles du répertoire classique (Tchekhov, Ibsen). Au début des années 80, elle écume les castings et débute au cinéma avec un petit rôle dans Mon oncle d'Amérique d'Alain Resnais. Elle décroche ensuite des apparitions dans plusieurs films; Psy, Les babas-cool et Guy de Maupassant.
En 1986, Catherine Frot est nommée au César de la meilleure actrice dans un second rôle dans Escalier C. Elle ne remporte pas le prix, mais devient peu à peu une actrice populaire. La révélation au grand public arrive en 1995 avec le personnage de Yolande dans la pièce de théâtre Un air de famille qui lui permet de décrocher le Molière de la comédienne dans une second rôle. Dans l'adaptation au cinéma par Cédric Klapisch, elle rafle cette fois le César de la meilleure actrice dans un second rôle en 1997. Deux ans plus tard, elle décroche son premier grand rôle dans La Dilettante de Pascal Thomas, dans lequel elle incarne une bourgeoise suisse exilée à Paris pour changer de vie. Dès lors, elle enchaîne les rôles (Chaos, Les soeurs fâchées, Boudu..) Elle retrouve à plusieurs reprises le réalisateur Pascal Thomas pour des enquêtes policières (Mon petit doigt m'a dit, Le crime est notre affaire, Associés contre le crime). En 2012, l'actrice donne la réplique à Jean d'Ormesson et incarne Danièle Delpeuch, cuisinière privée de François Mitterrand à la fin des années 80, dans Les saveurs du Palais.
Parallèlement, Catherine Frot poursuit sa carrière sur le petit écran et s'illustre dans des téléfilms, notamment Le dernier été (1997), téléfilm historique avec Jacques Villeret, ou encore L'affaire Christian Ranucci : le combat d'une mère (2007), drame qui relate l'histoire de l'avant-dernier condamné à mort français. Au théâtre, la comédienne revient régulièrement à l'affiche (Si tu mourais, Oh les beaux jours, Fleur de cactus).
En février 2016, elle remporte le César de la meilleure actrice pour le rôle de Marguerite Dumont dans Marguerite, réalisé par Xavier Giannoli.
Côté vie privée, Catherine Frot a été en couple avec le metteur en scène Pierre Pradinas dans les années 1970. Elle se marie ensuite avec le réalisateur Michel Couvelard en 1987. Le couple a une fille, Suzanne, d'origine mauricienne, adoptée en 1996. L'actrice indique en 2022 que leur fille travaille en Afrique, dans les droits humanitaires. Michel Coulevard et Catherine Frot divorcent en 2013. Catherine Frot retrouve l'amour auprès de Gilles Chiriaux, chef-restaurateur à Montmartre. Leur relation est révélée dans un communiqué officiel en juillet 2022, lors du décès du père de la comédienne, Jacques Frot.