Pauley Perrette est née le 27 mars 1969 à La Nouvelle-Orléans. Elle participe à plusieurs publicités et fait quelques apparitions au cinéma dans des films comme The Ring en 2002. Mais c’est à la télévision qu’elle trouve son bonheur. Dès le milieu des années 90, elle cumule les petits rôles dans des séries à succès à l’instar de Frasier en 1996, Dawson en 2001 et 24 en 2002.
Mais c’est en 2003 qu’elle connaît la consécration en décrochant le rôle d’Abigail Sciuto, la scientifique excentrique de l’équipe du NCIS. Pour ce rôle, la belle blondinette doit se teindre les cheveux, ce qui n’est pas sans risque puisqu’elle a souffert d’une violente allergie en 2014. Véritable touche à tout, elle est également auteure de plusieurs livres et a été à la tête d’un groupe de rock nommé Lo-Ball dont la chanson Can't Get Me Down fait partie de la bande originale du film La Revanche d’une blonde.
En octobre 2017, l'actrice annonce son départ de la série NCIS à la fin de la saison. En mai 2018, elle révèle la cause de son départ, et écrit sur son compte Twitter avoir été victime d'agressions lors du tournage.
Le 2 septembre 2022 dans une vidéo partagée sur son compte Twitter, Pauley Perrette a fait savoir qu'elle avait survécu à un AVC, survenu un an auparavant.
Côté vie privée, elle a été mariée à l’acteur et musicien Coyote Shivers puis à Michael Bosman. Depuis 2011, elle est fiancée à Thomas Arklie.