Née le 18 juin 1975 à Rocourt en Belgique, Marie Gillain grandit à la campagne dans un petit village à quelques kilomètres de Liège. Ses parents, Nadine et Philippe, restaurent une vieille ferme. Marie et sa soeur, Céline, vivent au beau milieu de la nature. Dans le jardin, la petite Marie bricole des saynètes, joue à la funambule et fait le spectacle pour toute la famille. Lycéenne, elle suit des cours de théâtre à l'atelier Le Vivier à Liège.
En 1991, pour son premier rôle, elle s'envole pour l'île Maurice et donne la réplique à Gérard Depardieu dans Mon père, ce héros de Gérard Lauzier. Le film est un véritable succès, la jeune actrice est révélée au grand public à tout juste 16 ans et reçoit une nomination aux César du meilleur espoir féminin. Quatre ans plus tard elle est consacrée avec le film L'Appât de Bertrand Tavernier, qui lui permet de décrocher le Prix Romy-Schneider. Philippe de Broca la choisit pour manier l'épée dans le Bossu en 1997.
Sa filmographie s'enrichit de rôles très variés dans la décennie suivante (Laissons Lucie faire !, Barnie et ses petites contrariétés, Ni pour ni contre (bien au contraire), Pars vite et reviens tard), Les femmes de l'ombre). L'actrice prête sa voix à l'un des personnages de Kung Fu Panda depuis 2007. Elle incarne la soeur de Coco Chanel dans le film d'Anne Fontaine, Coco avant Chanel, en 2009. L'actrice qui souhaite incarner des personnages de femmes plus matures, écrit sa motivation dans une longue missive au réalisateur Philippe Lioret et réussi à le persuader de la laisser interpréter le rôle de Claire, juge d'instance, dans Toutes nos envies (2011). En 2012, elle est à l'affiche de Landes de François-Xavier de Vives. En 2014 elle tourne Mirage d'amour avec fanfare aux côtés de Jean-François Stévenin sous la direction du réalisateur belge Hubert Toint.
Côté vie privée, Marie Gillain a deux filles; Dune née en 2004 de son union avec le musicien Martin Gamet, et Vega avec l'acteur Christophe Degli Esposti en 2009.